李丹1，李柏昌2，范艳艳3
     1.吉林大学第二医院医保科，吉林长春130041;
     2．长春市医疗保险管理中心药监部，吉林长春130062；
     3．吉林大学第一医院妇产科，吉林长春130021
&   【摘要】目的探讨空气负离子对体外培养的肝癌SMMC-7721细胞生物学活性的影响。方法将细胞随机分成3组：阴性对照组、空气对照组及负离子治疗组。治疗组根据空气负离子作用时间分成1h组、2h组、4h组和8h组。对所有细胞进行TUNEL染色检测细胞凋亡，流式细胞仪检测细胞的周期变化应用Westernbl 
        ot方法检测磷酸化P3 8MAPK的表达变化。
        结果 
        与阴性对照组和空气对照组比较，空气负离子治疗组细胞凋亡率明显增加，s期细胞所占有的比例明显下降，磷酸化P38MAPK表达明显上升，差异均具有统计学意义(P<0.05)。
        结论 空气负离子通过细胞周期阻滞而使肿瘤细胞发生凋亡，这种效应是通过P38MAPK这条信号通路传导的。
     【关键词】肝癌；空气负离子；P38MAPK
       已有实验证明空气负离子可以参与调节大脑皮质兴奋与抑制过程、改善睡眠、降低血压、加强气管粘膜细胞纤毛运动、增加基础代率、增进食欲、增强机体抵抗力及抗肿瘤等作用。但是所有实验几乎都是流行病学方面的调查，到目前为止尚没有人观察在实验室中利用人工产生的空气负离子对体外培养的肿瘤细胞的生物学作用的影响，我们此次观察体外培养的人肝癌SMMC-772l细胞在直接与空气负离子接触后的一系列生物学变化，现报告如下。
   
  l 材料与方法
    1．1  
        细胞及主要试剂肝癌细胞株SMMC-772l系温州医学院病理科惠赠，在含10%胎牛血清的RPMI—1640培养液，37℃、5%C02条件下进行培养，细胞传代用胰酶消化液(0.25%胰酶，0.02%EDTA)消化。碘化丙啶(P1)为美国Sigma公司产品。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒为德国Boehringer  Mannheim公司产品。鼠抗人单克隆抗体P38MAPK及P38MAPK特异性抑制剂sB203580均是美国Oncogene公司产品。sB203580使用终浓度为50umol/L。采用特制空气负离子发生器，空气负离子检测装置采用瑞典Model 
 IC2000型空气负离子检测器。

     1．2实验方法
     1．2．1     细胞分组  
       将培养为对数生长期的细胞随机分成3组，即阴性对照组、空气对照组、负离子治疗组。治疗组根据空气负离子作用时间分成1h组、2h组、4h组和8h组。对照组只给予普通空气做对照，空气负离子给予方法应用自制的可以在孵箱中持续给予空气负离子而不至于对细胞的生长产生影响的设施，将孵箱改造成相对密闭的空间，空气负离子可以通过电离持续不断的产生，电压维持在30.0kV，应用空气离子检测器来检测空气负离子浓度，在实验前保证空气负离子浓度不高于500/cm3，电离后维持空气负离子浓度在(2-3)×106/cm3rm。。

   1．2．2     
       TUNEL染色将5-l0代细胞用胰蛋白酶消化，制成密度为(104-lO5)/ml的细胞悬液。滴加细胞悬液于盖玻片上，1h后，细胞贴壁，补加培养基。待细胞生长达50％-60％，用无血清DMEM培养液洗2次，再加条件培养液，继续培养(24-48)h，收集盖玻片并应用4％多聚甲醛固定，爬片制作成功后进行如下染色步骤：
      ①梯度乙醇水化；
      ②3ml/L H2O2封闭30min；
      ⑧20mg/L蛋白酶K消化液作用20min；
      ④TUNEL反应液，37℃孵育60min；
      ⑤过氧化物酶连接的抗荧光素抗体，37℃孵育30min；②～⑤步后均以10mmol/L PBS(pH 7.4)振洗3次，每次5min；
      ⑥DAB显色，苏木素复染，脱水透明，封片。以PBS替代TUNEL反应液作阴性对照，阳性对照爬片经DNase 
       I预处理10min，再接TUNEL染色步骤。结果判定：光镜下观察TUNEl染色爬片的显色反应，数5个以上高倍视野，不少于1000个细胞，重复5次。细胞核中有棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。记数阳性细胞数并以百分数表示，作为细胞凋亡指数。

  1．2．3    
          应用流式细胞仪进行细胞周期分析收集消化的贴壁细胞，PBS冲洗后重悬在4℃、70％的乙醇中至少(1-2)h，以1000r/min离心细胞后重悬在含100mg/L 
  RNA酶和10mg/L碘化丙啶的PBS中，25C暗处孵育15min。用FACScali-bur流式细胞仪进行单色荧光细胞流式计数。结果用Multiplus 
  software II软件分析数据，每个样本收集10000个细胞，重复3次。

  1．2．4    western 
        blot方法检测空气负离子作用前后磷酸化P38MAPK的蛋白表达，取体外培养的l×107-8个7721细胞在1mlRIPA裂解缓冲液中匀浆提取蛋白，测定提取的蛋白浓度。每个上样孔加样30ug蛋白，经电泳、转膜后杂交，一抗为山羊抗人磷酸化P38MAP单抗(Santa 
  Cruz公司，l：400），二抗为HRP标记兔抗山羊IgG抗体(Santa 
  Cruz公司，l：4000)，ECL显色(Amersham公司)，拍照，密度扫描测各条带吸光度(IA)。以IA(目的条带/β-actin对照条带)，表达各标本上述蛋白含量，共重复10次。

  1．3    统计学处理采用SPSSl3.0软件进行统计学分析，计量资料用(X±s)表示，采用t检验。

  2 结果
  2．1   各组细胞凋亡率，S期占有率及P38MAPK的LA值见表1   

3 讨论
        空气负离子被喻为空气维生素，因其对人体健康有利而吸引科学界的目光。对空气负离子的研究开始于十九世纪五十年代，已经证明空气负离子有调整大脑皮质兴奋与抑制过程、改善睡眠、降低血压、加强气管粘膜细胞纤毛运动、增加基础代谢率、增进食欲、增强机体抵抗力等作用。医学家研究表明，空气负离了对人体的保健作用和辅助疗效大小与空气负离子浓度有关。当空气负离子浓度达到700个·cm3以上时才有益于人休健康：当浓度达到l万个·cm3以上时才能治病；当负离子浓度大于或等于正离子浓度时，才能使人感到舒适，并对多种疾病有辅助治疗作用。但是几乎没有体外研究其对细胞的直接作用效果及其相关机制，空气中的阳离子使人的神经焦虑、紧张，而负离子却可以使人放松神经和心情，Yamada等，研究认为空气负离子可以降低由高脂饮食而造成高脂血症的小鼠的红细胞的聚集作用，Iwama报道空气负离子可以提高红细胞的变形能力以及有氧代谢能力。PopperY等曾系统研究空气负离子的抗肿瘤作用，他将水产生的空气负离子和电产生的空气负离子做对比，阐述了空气负离子可以抗小鼠的肿瘤的产生和生长，其机制与其增加小鼠体内的NK细胞的活性有关，其抗肿瘤作用与其吸入的时间和剂量成正比，同时阐明水产生的空气负离子较电产生的空气负离子效果更加明显。我们此次实验通过对体外培养的肝癌细胞观察空气负离子直接作用在细胞上所产生的生物学反应，结果发现空气负离子可以明显诱导肝癌SMMC-7721肿瘤细胞的凋亡，S期细胞在各期细胞中所占有的百分率明显下降，同时在细胞发生凋亡时表达的磷酸化的P38MAPK明显增加，其中以负离子作用时间4h组最为明显，与1h和2h组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。加入SB203580后在抑制了P38MAPK的同时也抑制了其他一系列生物学效应。这说明空气负离子通过使细胞周期阻滞而使肿瘤细胞发生凋亡，这种效应是通过P38MAPK这条信号通路传导的。
  4 参考文献略 

吉林大学第二医院空气负离子对体外培养的肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用及其相关的信号传导机制.pdf